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Le récepteur II type 1A interagit avec les phosphates de phosphatidylinositol et module l'attachement de la membrane RésuméLe terminal carboxylique d'un type de 1 récepteur de l'angiotensine II (AT1A) Régulait l'activation / désactivation du récepteur et l'hélix 8 amphipathique à l'intérieur de la terminaison carboxyle est un motif d'arrangement d'affinité élevée pour les lipides de la membrane plasmatique. Nous obtenons une interférométrie à double polarisation (DPI) Pour examiner le rôle des phosphatidylinosites dans votre reconnaissance d'Helix 8 dans le récepteur AT1A. Un peptide synthétique communiquant à Leu305 à Lys325 (Helix 8 AT1A) Discriminé entre les PIP et diverses charges sur les membranes lipidiques. Le maintien de peptide sur PtdIns (4) P composé de bicouches a provoqué un changement spectaculaire dans la biréfringence (Une façon de mesurer l'ordre de la membrane) par la bicouche. La modélisation cinétique a démontré que PtdIns (4) P est maintenu au-dessus de la bicouche avant que la masse du peptide lié atteigne un seuil. Immédiatement après l'insertion des peptides dans la bicouche. Cela suggère que Helix 8 peut répondre à l'inclusion de PI (4) P en sortant de la bicouche, en créant un changement de conformation fonctionnelle dans le récepteur. IntroductionG nécessite des quantités de protéines couplées aux récepteurs (GPCR) sont la plus grande superfamille des récepteurs de la surface cellulaire1. Étant donné que les GPCR sont des cibles essentielles2, l'élucidation des mécanismes qui activent / désactivent les GPCR est fondamentale pour élargir notre compréhension de ces récepteurs et l'introduction de nouvelles thérapies. Le motif de signature des GPCR est constitué de sept hélices d'extension transmembranaires qui forment une poche de liaison au ligand extracellulaire / membranaire intra-membranaire et une face cytoplasmique qui couple les protéines G et favorise la signalisation. L'angiotensine met 1 récepteur (AT1R) est un GPCR de 359 acides aminés qui agit sur l'exercice cardiovasculaire important et les actions homéostatiques de l'hormone peptidique, l'angiotensine II (AngII) 3,4. Il couple essentiellement à la protéine G hétérotrimérique, Gq / 11, Pour induire la phospholipase C (PLC), où hydrolyse le phosphatidylinositol (4,5) Bisphosphate (PtdIns (4,5) P2, PIP2). Pour produire les seconds messagers solubles, le Diacylglycérol ( DAG) Et en outre, le inositol (1,4,5) Trisphosphate (IP3) 5. Ces messagers, à leur tour, stimulent la protéine kinase C et augmentent respectivement le calcium intracellulaire, ce qui favorise les réponses cellulaires qui sont la prémisse des actions AngII (Principalement, vasoconstriction, lancement d'aldostérone, désir et envie de sel) 3. L'activité non suffisante du système de signalisation AT1R entraîne une hypertension artérielle et une hypertrophie rénale et vasculaire et des antagonistes non peptidiques de l'AT1R sont utilisés pour abaisser le niveau de pression sanguine, soulager le dysfonctionnement cardio-cardio-vasculaire et prolonger la vie. Une caractéristique hautement conservée de l'ensemble prototypique sept transmembranées de GPCRs est l'une autre hélice (Called Helix 8), qui comprend les 15 premiers 20 acides aminés de l'extrémité C intracellulaire et est parallèle à la bicouche lipidique3,4,6. Cette région du GPCR est un point focal pour de nombreuses relations protéines protéines qui sont cruciales pour le couplage des récepteurs aux protéines G et autres molécules de signalisation / régulatrice. Nous et d'autres ont précédemment montré qu'un peptide équivalent à l'hélice 8 de l'AT1R (Leu305 vers Lys325, d'habitude en général AT1R H8) Affiche une liaison à haute affinité à CaM dans l'utilisation de calcium7,8. Nous avons également utilisé des peptides synthétiques et des membranes modèles pour montrer que AT1R H8 se lie avec une forte affinité aux bicouches phospholipides par des interactions électrostatiques et hydrophobes9,10,11. Juste avec palmitoylation) 10. Comme étant, cette région hélicoïdale est plus susceptible d'être attachée à la membrane plasmatique au lieu de s'étendre jusque dans le cytoplasme, et en effet les enveloppes de cristal des GPCR, par exemple le récepteur adrénergique et le récepteur d'adénosine A2A. Indiquer que cette région s'oppose à la notice interne de la Membrane plasmatique12,13,14. Beaucoup de GPCR possèdent des syntontiques, des câbles d'extension hélicoïdaux putatifs de TM7, en prévoyant que, même sans l'acylation sur les résidus de cystéine, certaines queues de récepteur peuvent s'attacher dynamiquement à la membrane par l'intermédiaire de l'interaction des lipides de la chaîne latérale pour réguler la structure et la fonction du récepteur local. Le rôle des lipides impliquant la membrane plasmique est donc non seulement de fournir une barrière physique à la cellule, mais aussi d'agir en tant que corps gouvernementaux dynamiques de la structure et de la fonction des protéines membranaires intégrales15,16,17 et nos études suggèrent que AT1R H8 joue un rôle central Rôle dans la fonction du récepteur et que la membrane plasmatique est un régulateur de cette fonction10,11,18. Les phospholipides anioniques, Ce type de PIPs, interconnectent électrostatiquement avec des protéines polybasiques16,19,20,21, ainsi que la région Helix 8 des GPCR, avec les multiples résidus de base, est un candidat probable pour cette communication et interaction. Plusieurs rapports indiquent que les phospholipides anioniques, par exemple la phosphatidylsérine (PS) ou PIPs, peuvent se grouper pour former des microdomaines distinctifs pour la signalisation intracellulaire18,22,23,24. Dans notre étude, nous commençons à utiliser l'interférométrie à double polarisation (DPI) Pour analyser la liaison de la liaison de AT1R H8 à de nombreux types de bicouches. Les données sont analysées en utilisant les méthodes cinétiques que nous avons introduites en ce qui concerne l'analyse des données DPI25, qui permettent le montage combiné des données de masse et de biréfringence, et expliquent également le potentiel d'expansion latérale dans la bicouche lipidique à la suite d'interactions membranaires peptidiques. Cette nouvelle approche, en conséquence, permet non seulement d'analyser la liaison, mais permet également de dévoiler et de quantifier des ajustements à la structure de la membrane. Nous présentons des preuves que la clé associée à la membrane pour cette interaction sont les phosphatidylinositols et nous avons étudié une interaction spécifique entre AT1R H8 et les lipides de phosphate de phosphatidylinositol (PIP référant à toutes les espèces). RésultatsDéposition de bicouches lipidiquesDMPC est un type bicouche zwitterionique avec une charge neutre globale pour représenter un contrôle pour d'autres bicouches avec d'autres propriétés. Étant donné que l'objectif principal est de vérifier la liaison spécifique d'Helix 8 aux PIP, il est important de contrôler également la possibilité que des changements de liaison résultent d'une augmentation globale de charge plutôt que d'une liaison spécifique aux PIP. En tant que tel, non spécifique Les changements dans la liaison ont déjà été observés25. Les composants ajoutés du mélange de phospholipides ont été choisis pour imiter la feuille intracellulaire de la membrane plasmique où se trouve Helix 8. DMPS est vu dans la notice interne de la membrane plasmatique eucaryote, donc son inclusion dans les bicouches permet un conseil plus précis des conditions biologiques. PI (4,5) P2 a été choisi car il a établi le fait comme une molécule de signalisation lipidique, et est l'un des effecteurs en aval de la signalisation AT1R. PI (4) P a été choisi pour comparer et contraster, examiner si la quantité et le positionnement des groupes phosphate sont significatifs. Chaque bicouche a été déposée pour les méthodes décrites précédemment25,26,27,28 et les propriétés de chaque bicouche lipidique sont listées dans le tableau 1 et révèlent que les valeurs de densité, de masse et de biréfringence étaient très stables. Acquérir, l'effet de l'agencement lipidique sur la liaison de AT1R H8 aux imitations de la membrane (DMPC, DMPC / DMPS (80:20), DMPC / DMPS / PI (4) S (76: 20: 4) Outre DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 (76: 20: 4)) a été analysé par DPI. Des solutions peptidiques d'attention croissante (0,5 10 mètres) Des bicouches fraîchement préparées. Figue. 1 montre les parcelles de conversion de masse (A good, G, I, Gary) Et la biréfringence varie (M. T, F ree p, L) Par opposition au temps. Les terrains de masse de masse et le temps montrent une phase de liaison primaire (Avec un traitement peptidique qui circule sur la bicouche et se liant à la membrane) En plus d'une phase de dissociation (Avec un tampon en vrac qui coule à une bicouche récente) Hits, la marque est un peptide Se dissocie de la membrane (jeter un coup d'oeil à l'utilisation «reformat de masse» Et après cela «adaptation de la biréfrence» Pour désigner la distinction entre la masse mesurée ou la biréfringence et celle de la bicouche à lipides fraîche). Les changements de masse ont augmenté votre phase de liaison car le peptide lié à la bicouche, et pour des concentrations plus élevées de certains, mais pas beaucoup, du peptide lié dissocié de la bicouche tout au long de la phase de dissociation. Une très faible dissociation des peptides a été observée pour des niveaux inférieurs. La liaison globale de AT1R H8 aux membranes anioniques était supérieure au DMPC zwitterionique, avec une capture encore plus élevée à DMPC / DMPS / PI (4) S, à la fois sur le changement de masse et le changement de biréfringence. Pour les variations de la biréfringence après quelques instants (figure 1b, Deb, F et, en outre, h), une tendance similaire aux changements de masse a été observée mais avec un signe d'étranglement, la biréfringence diminuant dans la phase de liaison, mais la récupération pendant la phase de dissociation pour Concentrations plus élevées de mit. Figure 1Plots de changements de masse et de biréfringence par rapport au temps pour AT1R H8 aux niveaux 0.5M (ligne Denims), 1M (zone rouge), 2M (ligne conviviale pour la terre), 5M (ligne jaunâtre), combiné avec 10M (Bleu le filet) : Unification pour les lipides DMPC (Mass ajuste par rapport à Times, (A ray ban aviator 3025 taille 58 fabulous); Birefringence change vs Opportunity, (D); DMPC / DMPS (Mass améliore vs Un moment, (T); Amélioration de la biréfrence par rapport à une période libre Du moment de la durée, (Anj); DMPC / DMPS / PI (4) V (Amélioration du mode de vie de masse par rapport à la période A (Vitamine y); Birefringence change vs Moments, (Y); DMPC / DMPS / PI (4, 5) P2 (Transitions de style de vie de masse vs Moments, (Grams), remplacements de Birefringence vs Un moment, (L). Tendances des variations de masse et de biréfrence par rapport à la quantité Le changement de masse maximal pour chaque action et le type de lipide est représenté à la Fig. 2a. La liaison AT1R H8 au DMPC était remarquablement faible, à 0.3n / mm2 autour de 2M, et a augmenté seulement lentement avec des niveaux supérieurs à environ 0,45ng / mm2 à 10 M. La liaison au DMPC / DMPS était complètement supérieure, en ajoutant 0,45ng / mm2 à 2M et en plus de 1,1ng / mm2 à 20M. Cette augmentation est probablement due à la charge négative des molécules de DMPS qui attire plus fortement les résidus chargés de AT1R H8. Pour des niveaux allant jusqu'à 5M, la masse de peptide liée à DMPC / DMPS / PI (4) P était presque identique à celle de DMPC / DMPS; À la, pour la plus grande focalisation (10M), la dureté de la liaison à la membrane contenant PI (4) P a continué à générer nettement, presque augmentant de 5M à 10M, alors que pour DMPC / DMPS, il n'y avait qu'une légère adhérence. Pour trouver le modèle distinctif DMPC / DMPS / PI (4,5) P2, la liaison a été supérieure à celle de DMPC / DMPS et DMPC / DMPS / PI (4) P à 2 et en particulier de 5M, mais n'a pas encore augmenté à 10M . Carte 2Maximum de changement de masse (haut et bas de l'axe, figure 2a) et réglage de la biréfringence (axe droit, figure 2b) Pour AT1R H8 tenant à DMPC (groupes bleus), DMPC / DMPS (80:20) (triangles gris), DMPC / DMPS / PI (4) V (76: 20: 4) (anneaux de diamants verts), alors que DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 (76: 20: 4) (morceaux pourpres), pour les niveaux de peptides allant de 0,5 dans l'ordre à 10M (axe horizontal). Les barres d'erreur affichent une erreur standard d'au moins 3 tests indépendants. Le changement de biréfringence maximum est compris comme le meilleur écart (si bon ou mauvais) pendant la période d'injection conformément à la ligne de base avant l'injection. Les changements de biréfringence pour chaque type de lipide à différentes concentrations de mit de AT1R H8 sont représentés sur la Fig. 2b. À des concentrations plus élevées de mit, les styles de biréfringence reflètent les développements pour la masse, avec des niveaux de masse plus élevés semblables à des changements de biréfringence plus négatifs. Mais à l'esprit, à des niveaux inférieurs, DMPC / DMPS / PI (4) P subit un changement de biréfringence positif aux niveaux les plus bas, 0,5 puis 1M, et seulement un changement de biréfrence négatif très faible (En tout temps, par exemple, à DMPC / DMPS avec une liaison de masse similaire) Participer à 2M. Les effets exacts, mais moins aussi bien que sont observés pour DMPC et DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 qui ne montrent pratiquement aucun changement de biréfrence à 0,5 et, en outre, 1 M, par rapport à DMPC / DMPS qui avait un rapport assez cohérent entre La masse et la biréfringence changent malgré la concentration. AT1R H8 Changements induits dans l'ordre membranaire Modèle qualitatif des résultats de masse de la biréfringence L'analyse des changements dans la structure de la membrane lors de la liaison aux peptides révèle un mécanisme possible de liaison AT1R H8 en termes d'association de surface et de changements structurels membranaires. Pour effectuer cette analyse, les parcelles de masse de biréfringence pour 10M AT1R H8 montrent les caractéristiques qualitatives de la liaison AT1R H8 et seront analysées quantitativement dans la section suivante. Et la construction de parcelles de terre de masse et de biréfringence par rapport au temps est établie dans les figures 1,2, respectivement. En ce qui concerne le DMPC (figure 3a), tout est devenu entre la biréfringence et la masse est linéaire, avec l'amélioration de la masse et la biréfringence diminuant pendant la phase de liaison, et la diminution de la masse et la biréfringence progressive pendant la phase de dissociation. Juste combien de liaison pour DMPC était inférieure à celle des autres types de bicouches. Pour avoir DMPC / DMPS (figure 3b) Le tracé est comparable, mais juste un peu moins linéaire, avec un gradient peu profond lors de la liaison préliminaire. Et le graphique a accompli l'évolution de la phase de liaison pendant la phase de dissociation (La biréfringence est la plus basse) . Mais pourtant, pour gagner DMPC / DMPS / PI (4) K (figure 3c), le motif était nettement rare; Le graphique tracé à plat (avec peu d'améliorations sur la biréfringence) à travers la masse a atteint environ 0,4ng / mm2, après quoi la biréfringence a chuté rapidement jusqu'à atteindre approximativement le même taux de changement de masse de biréfrence que pour DMPC / DMPS. La phase de dissociation retraçait presque exactement les prochaines étapes de la phase de liaison. DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 (Fig. 3d) Indique un motif modérément courbé de manière similaire à celui de DMPC / DMPS, mais pour cette phase de dissociation, la phase de liaison est plus proche. Additionnez 3 parcelles de biréfringence par rapport à la masse pour les données fraîches et un modèle sélectionné pour la liaison AT1R H8 à diverses bicouches lipidiques. Le modèle sélectionné donne le meilleur équilibre entre un bon ajustement et évite des paramètres excessifs qui n'ajoutent que légèrement l'ajustement. (A complet): données d'essai et d'erreur pour la liaison Helix 8 à DMPC (points Burgandy), avec le modèle à trois états avec une extension bicouche adaptée aux données (sélection rouge). (D): données fraîches pour Helix 8 liaison à DMPC / DMPS (groupe bleu), avec le modèle à deux états adapté aux données (Red the internet). (D): données fraîches pour Helix 8 liaison à DMPC / DMPS / PI (4) Delaware (zone bleue), avec le modèle à trois états avec une expansion bicouche et une patience de masse adaptée aux données (Red the web). (N): données fraîches pour Helix 8 liaison à DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 (sélection bleue), avec le modèle à trois états avec une expansion bicouche et une patience de masse adaptée aux données (groupe rouge). Modélisation cinétique des interactions membranaires AT1R H8La modélisation cinétique des données de masse et de biréfringence a été pratiquée pour chaque événement de liaison en utilisant un ensemble de modèles apparentés. Les erreurs de moindres carrés normalisées pour l'ajustement supérieur pour chaque modèle sur chaque bicouche sont listées dans le tableau 2. Le modèle à deux états était le modèle le plus simple utilisé, pour représenter le processus auquel un peptide se lie à la surface, formant le premier état en tant que Mélanger le peptide et les lipides associés comme décrit précédemment25. Ce premier état se déroule ensuite soit pour se dissocier de l'extérieur, soit transformé en second état, ce qui peut alors revenir au premier état. La sortie visuelle de chaque ajustement est représentée sur la Fig. 4 et le taux de chaque changement est présenté par une constante cinétique indiquée dans le tableau 3. De même, on suppose que tous les deux états liés à la membrane affectent la biréfringence de la bicouche lipidique proportionnellement à la masse de peptide lié dans cet état; La grandeur relative de cet effet explique les constantes n1 et n2 (Workplace 3). Le modèle à trois états est une extension logique de ces deux modèles d'état où l'état relié à la deuxième membrane peut se transformer en un troisième état, et inversement. En plus de cela, ces modèles doivent souvent être modifiés en tenant compte de l'expansion bicouche, où la masse par unité de surface de la bicouche lipidique diminue en raison des conversions d'états peptidiques. Dans les événements présentés ici, l'hypothèse est que seul le ray ban aviator noir taille 58 dernier état (Le deuxième état de ces deux modèles d'état, en tant que troisième état du modèle à trois états) permet l'expansion bicouche. Temps pour la liaison de 10M Helix 8 pour les bicouches lipidiques et le modèle qui complète la Fig. 3, Indication, Délai approprié, Données fraîches (Canal bleu) Et n'est pas un changement de masse / biréfringence (Limite de pêche rouge), D'abord vous dire (ligne brune), Deuxième suggérer (ligne verte), Troisième dire (Cyan the web), Et effet de la croissance bicouches (ligne de teinte jaune). Les graphiques sont pour un autre lipides et modèles: DMPC utilisant un modèle à trois états avec un proxy bicouche, des transformations de masse (parfait) et des différences de biréfringence (H); DMPC / DMPS en utilisant un modèle à deux états sans prolifération bicouche, la masse diffère (B) et les améliorations de biréfrence (Debbie); DMPC / DMPS / PI (4) P en utilisant un modèle à trois états avec une tolérance de masse et une expansion bicouche, des améliorations de mode de vie massif (U) et des commutateurs de biréfrence (Farreneheit); DMPC / DMPS / PI (4,5) P2 en utilisant un modèle à trois états avec une limite de masse et une expansion bicouche, le réglage de masse (Gary) Et la biréfringence tourne (L). Espace de travail 3: frontières pour les modèles sélectionnés (avec les ajustements sélectionnés représentés sur la figure. Deux idées ont été suggérées: soit la bicouche répond très lentement à la liaison du peptide en fournissant un délai important entre les changements de liaison et de biréfringence (Induire le modèle de retard de biréfringence); Le processus du premier état au second état est empêché jusqu'à ce qu'un certain seuil pour la masse de peptide par unité de surface soit passé (Induire le modèle de seuil de masse). Il est identifié que, compte tenu de la complexité de l'interaction protéique lipidique, ces modèles ne caractérisent que Une approximation des processus physiques se produisant, et ne devrait pas être censé fournir une adaptation exacte aux données. Le modèle à deux états a donné un ajustement compétitif à la courbe de liaison DMPC (Fig. 4a, G) Avec une erreur de moindres carrés stabilisée combinée (ci-après dénommée simplement l'erreur) Relatif à 0.389, réduit un peu plus à 0.356 en considérant l'expansion bicouche. L'ajustement des trois états a réduit l'erreur à 0.177, Environ la moitié de l'erreur de ces deux états. Bien que, ils varient de l'état à l'état trois, ajoute également trois paramètres au modèle. Donc, si l'ajustement à trois états fait une amélioration de la clé n'est pas clair. Le modèle supplémentaire de modèle de la latence de la biréfringence et le modèle de seuil de masse n'ont pas amélioré notablement l'ajustement. Le modèle à deux états a donné une approche très proche de la courbe de capture DMPC / DMPS (Fig. 4c, K), avec une erreur de seulement 0,105, ce qui n'a pas été notablement amélioré en incluant l'expansion de la bicouche, le retard de Birefringence ou une patience de masse. Le modèle à trois états a amélioré la grosse erreur jusqu'à 0,085, et l'ajout d'une expansion bicouche réduit encore cette valeur à 0,051. Tout comme DMPC, cela connote environ la moitié de l'erreur pour le modèle à deux états, et encore une fois, il n'est pas facile de conclure si cela représente une différence réelle dans le mécanisme. En particulier, le premier modèle d'état a donné un très bon ajustement. Le modèle de deux états et le modèle à trois états ont donné des ajustements inadéquats à la courbe de présentation DMPC / DMPS / PI (4) P (figure 4e, Ver), à la fois avec et sans croissance bicouche. En revanche, le modèle à trois états a donné une amélioration significative de l'ajustement en utilisant le retard de biréfringence ou le seuil de masse. Avec la grande erreur de 0.796 pour le modèle à trois états avec le proxy bicouche à 0.319 (en utilisant le retard de biréfrence) et 0.303 ( Pour le modèle de patience de masse) Respectivement. Pour le modèle de tolérance de masse, il y avait une petite valeur n1, spécifiant peu de perturbation de la bicouche dans le premier état, alors que les valeurs n2 et n3 étaient plus similaires à celles observées avec d'autres types de bicouche lipidique. Pour comparer, la modélisation cinétique a également été utilisée pour s'adapter à la puissance 5M de AT1R H8 sur DMPC / DMPS / PI (4) T (Toy S1, Platform S1). Un modèle à deux états était une quantité suffisante pour donner un ajustement très étroit; De la même manière que le niveau de contenu 10M, le premier état avait un coefficient de masse de biréfringence nulle n1, et le second état était encore plus grand. Mais la vérité est qu'il n'y avait aucune exigence pour un troisième état, ou une limite de masse. Cela suggère que les deux premiers états sont typiquesPour cette combinaison peptide / lipide, alors que la dynamique qui donne naissance à un état tiers moche ne peut apparaître qu'à des concentrations plus élevées. Il est remarquable que la sensibilisation à la 10M a entraîné une réduction significative de la masse (présomptivement de la dissociation des peptides) par la phase de dissociation, alors qu'il n'y avait pratiquement aucune dissociation pour l'attention 5M (une qualité de modèle à travers plusieurs exp

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